ПРАКТИЧЕСКИЙ РАЗДЕЛ

---

План-график проведения лабораторных занятий

по разделу «Метаболическая биохимии»

№	Тема занятия	Форма контроля
1	Количественное определение АТФ и креатинфосфата в мышцах	Отчет в тетради, Устный опрос
2	Спиртовое брожение	Отчет в тетради, Контрольная работа
3	Эмульгирование и гидролиз жиров	Отчет в тетради, Устный опрос
4	Гидролиз белка	Отчет в тетради, Устный опрос
5	Качественные реакции на инсулин	Отчет в тетради
6	Качественное определение адреналина	Отчет в тетради, Контрольная работа

 

---

ЛАБОРАТОРНЫЕ РАБОТЫ

Лабораторная работа 1
Количественное определение АТФ и креатинфосфата в мышцах

В мышечной ткани содержится два макроэргических соединения – АТФ и креатинфосфат, которые обеспечивают по мере надобности мышцу энергией. Метод основан на том, что два последних остатка фосфорной кислоты в АТФ, богатые энергией, как и фосфорный остаток в креатинфосфате, легко отщепляются при непродолжительном гидролизе в кислой среде – т.н. лабильно связанный фосфор. Сравнение содержания неорганического фосфора в пробах до и после гидролиза дает представление о количестве лабильно связанного фосфора, которое приходится на макроэргические соединения мышечной ткани. Количество фосфора определяют по цветной реакции с молибдатом аммония в присутствии аскорбиновой кислоты.

Реактивы:

1. Мышечная ткань животного.

2. Трихлоруксусная кислота (ТХУ), 2,5 %-ный раствор.

3. Соляная кислота (HCl), 1 М ратвор;

4. Гидроксид натрия (NaOH), 1 М раствор;

5. Молибдат аммония ((NH₄)₆Mo₇O₂₄), 1 %-ный раствор.

6. Аскорбиновая кислота, 1 %-ный раствор.

Оборудование: кристаллизатор со льдом; гомогенизатор; бумажные фильтры; пробирки (в том числе мерные); пипетки; воронка; химический стакан; спиртовка; пробиркодержатель; аналитические весы; кюветы; фотоэлектроколориметр (или спектрофотометр).

Выполнение работы. 0,5 г мышечной ткани животного гомогенизируют во льду в 5 мл охлажденной 2,5 % ТХУ. Фильтруют в мерную пробирку. Осадок на фильтре промывают 5 мл холодной дистиллированной воды. Объем доводят до 10 мл. Содержимое пробирки разделяют на 2 равные части и далее выполняют опыты согласно схеме:

Реагенты	Количество реагента, мл
	Опыт, мл	Контроль, мл
Безбелковый фильтрат	0,5	0,5
HCl	1,0	1,0
	Кипятить 10 мин (гидролиз фосфорных связей), охладить	Не кипятить
NaOH	1,0	1,0
H₂O	7,5	7,5
Перевести по 5 мл жидкости в другие пробирки
Молибдат аммония	0,5	0,5
Аскорбиновая кислота	0,5	0,5
H₂O	2,0	2,0
Смесь в пробирках перемешать, экспозиция 10 мин при комнатной температуре.
Определяют оптическую плотность (D) при длине волны 670 нм, в качестве контроля используют дистиллированную воду

В опытной пробе (после гидролиза) определяемый неорганический фосфор представляет собой сумму лабильно связанного фосфора и фосфатных солей, присутствующих в тканях, в контрольной пробе – только фосфатные соли. Вычитают из оптической плотности, найденной для опытной пробы, оптическую плотность, полученную для контрольной пробы. Концентрацию лабильно связанного неорганического фосфора в пробе находят по калибровочному графику.

Рассчитывают количество лабильно связанного фосфора, учитывая разведение:

Х = А × 3,3 × 400 × 1000,

где Х – содержание макроэргических соединений в пересчете на 1 мг АТФ в 1 кг сырой ткани;

А – содержание АТФ в пробе, мг;

3,3 и 400 – коэффициент пересчета на 1 г ткани с учетом разведения растворов.

Сформулируйте цель работы и сделайте вывод о количестве лабильно связанного фосфора в проанализированной мышечной ткани.

Лабораторная работа 2
Спиртовое брожение

Брожение – анаэробное ферментативное расщепление органических веществ, преимущественно углеводов. Служит источником энергии (энергетический выход – 2 молекулы АТФ с одной молекулы глюкозы) для жизнедеятельности организмов и играет большую роль в круговороте веществ в природе. Его считают наиболее древним из биологических механизмов получения энергии.

Последовательность реакций превращения глюкозы до ПВК – гликолиз – имеет сходства у всех организмов (раздел 3.1). При спиртовом брожении этанол образуется из пирувата при участии дрожжей (рисунок 15, раздел 3.3).

Реактивы: 1. Дрожжи свежие. 2. Гидроксид натрия (NaOH), 10 %-ный раствор. 3. Глюкоза (С6Н12О6), 5 %-ный раствор. 4. Раствор Люголя (I<2 в KI), 10 %-ный раствор. Оборудование: 1. Бродильный приборчик (рисунок 84). 2. Бумажные фильтры. 3. Весы. 4. Водяная баня. 5. Воронки. 6. Химический стакан. 7. Термометр. 8. Фарфоровая ступка с пестиком. 9. Электроплитка.

Выполнение работы. 0,5 г свежих дрожжей растирают в фарфоровой ступке с 10 мл 5 %-ного раствора глюкозы. Смесь переливают в пробирку бродильного приборчика и доливают до краев 5 %-ным раствором глюкозы. Собирают бродильный приборчик, ставят его на водяную баню и выдерживают 1–1,5 часа при температуре 38–40 ºС. Образовавшийся углекислый газ собирается в верхней части закрытого колена приборчика, а жидкость перемещается в открытое колено. Затем, жидкость из открытого колена сливают в стакан и анализируют.

Обнаружение углекислого газа. В открытое колено бродильного приборчика наливают 10 %-ный гидроксид натрия, плотно закрывают пальцем отверстие и несколько раз переворачивают прибор. СО₂ поглощается щелочью и палец втягивается внутрь с такой силой, что приборчик удерживается на пальце в висячем положении. Кроме этого, наличие углекислого газа можно определить при помощи тлеющей лучинки.

Обнаружение спирта. Небольшое количество жидкости из стакана фильтруют через бумажный фильтр и к фильтрату добавляют 1 мл 10 %-ного гидроксида натрия и по каплям раствор Люголя. Образуется иодоформ, который имеет характерный запах и цвет. Образование иодоформа можно представить следующими уравнениями реакций:

Иодоформ (трииодометан) – в чистом виде твердое вещество желтого цвета с резким характерным запахом, плохо растворим в спирте, эфире хлороформе, практически не растворим в воде. Применяется наружно как антисептическое средство.

Сформулируйте цель работы и сделайте вывод о продуктах спиртового брожения.

Лабораторная работа 3
Эмульгирование и гидролиз жиров

Жиры, чтобы подвергнуться действию липаз, должны быть предварительно эмульгированы. Желчные кислоты – поверхностно активные вещества, являющиеся основными эмульгаторами жира в пищеварительном тракте. Желчные кислоты поступают с желчью в двеннадцатиперстную кишку, обволакивают капельки жира и препятствуют их слиянию. Желчные кислоты – холевая, дезоксихолевая, хенодезоксихолевая и литохолевая – являются производными холановой кислоты.

Белки, мыла, соли угольной кислоты, содержащиеся в некотором количестве в двенадцатиперстной кишке, также эмульгируют жиры.

Эмульгирование жиров

Взбалтывая жир с водой, можно наблюдать образование расслаивающейся, нестойкой эмульсии. Добавляя поверхностно активные вещества, можно получить стойкую эмульсию. Эмульгаторы легко адсорбируются на поверхности раздела двух фаз, образуя тончайшую пленку, которая препятствует слиянию капелек эмульсии.

Реактивы:

Растительное масло

Мыло, 1 % раствор;

Карбонат натрия (Na₂CO₃), 1 %-ный раствор;

Раствор яичного белка, 1 %-ный раствор;

Желчь (фармакологический препарат).

Выполнение работы. В 5 пробирок наливают по 3 капли растительного масла. Добавляют в 1-ю пробирку 20 капель дистиллированной воды, во 2-ю – 20 капель желчи, в 3-ю – 20 капель 1 % раствора яичного белка, в 4-ю – 20 капель 1 % раствора мыла, в 5-ю – 20 капель 1 % раствора карбоната натрия. Все пробирки тщательно взбалтывают. Через 5 минут наблюдают сохранение эмульсии.

Результаты занести в таблицу 5, отметить сохранилась ли образовавшаяся эмульсия; если сохранилась, указать степень ее дисперсности.

Таблица 5 – Эмульгирование растительного масла

Параметр	Мыло	Вода	Желчь	Белок	Сода
Сохранение эмульсии
Степень ее дисперсности

Гидролиз жиров

Жиры, или триацилглицерины, практически не всасываются в пищеварительном тракте. В тонкой кишке происходит их гидролиз, который катализируется липолитическими ферментами, вырабатываемыми поджелудочной железой. Существует несколько типов панкреатических липаз. Одни из них специфичны в отношении эфирных связей в α-положении триацилглицерина, а другие гидролизуют связи в β-положении. Полный гидролиз триацилглицеринов происходит постадийно: сначала гидролизуются α-связи, а затем более медленно гидролизуются β-моноацилглицерины. Конечные продукты переваривания (глицерин, высшие жирные кислоты, моно- и диацилглицерины) всасываются в стенках кишечника.

В процессе переваривания и всасывания липидов важную роль играют желчные кислоты. Они эмульгируют жиры, активируют липазу и обеспечивают всасывание нерастворимых продуктов переваривания.

Реактивы:

1. Молоко, разведенное в соотношении 1:10.

2. Спиртовой раствор фенолфталеина.

3. Гидроксид натрия (NaOH), 0,01 н.

4. Панкреатин, содержащий липазу.

Оборудование: химические стаканы; колбы для титрования; бюретки; мерные пипетки; водяная баня; термометр, электроплитка; термостат.

Выполнение работы. Готовят 3 химических стакана для опытных и контрольной проб. Для контрольной пробы липазу, содержащуюся в панкреатине, предварительно кипятят в течение 10 мин на кипящей бане. В каждую колбу наливают молоко, препарат липазы и желчь, как указано в таблице 6.

Приготовленные инкубационные смеси тщательно перемешивают. Затем из каждого стакана отбирают по 2 мл смеси в заранее приготовленные колбы для титрования. Титруют раствором 0,01 н NaOH в присутствии фенолфталеина до слабо-розового окрашивания.

Таблица 6 – Порядок выполнения опытов гидролиза жира

Компоненты инкубационной смеси	Опыт 1, мл	Опыт 2, мл	Контроль, мл
Молоко (разведенное в соотношении 1:10)	10	10	10
Препарат липазы	1	1	1 (прокипяченная)
Препарат желчи	–	1	–

При первом титровании нейтрализуются органические кислоты – молочная и другие, – которые присутствуют в молоке до начала действия липазы. Оставшуюся в колбах смесь помещают в термостат (температура 38–40 °С), через определенные интервалы (10, 20, 30, 40 мин) из каждой пробы отбирают, не вынимая из термостата, по 2 мл смеси и титруют 0,01 н раствором NaOH. Время титрования и объем гидроксида натрия фиксируют в таблице:

Таблица 7 – Результаты опыта гидролиза жиров

Время инкубации, мин	Объем NaOH, пошедшего на титрование, мл
	Опыт 1	Опыт 2	Контроль
0
10
20
30

Результаты первого титрования, полученного до начала действия липазы, вычитают из результатов последующих титрований. На основании полученных данных строят график, где по оси абсцисс откладывают время (в минутах), а по оси ординат – активность липазы, выраженную объемом раствора NaOH (мл), потраченного на нейтрализацию жирных кислот, образовавшихся за данный отрезок времени.

Сформулируйте цель работы и сделайте вывод об условиях работы липазы.

Лабораторная работа 4
Гидролиз белка

В зависимости от применяемого катализатора различают кислотный, щелочной и ферментативный гидролиз. При гидролизе простого белка конечными продуктами являются только аминокислоты. В организме гидролиз белка постоянно происходит в процессе как пищеварения, так и жизнедеятельности клеток под действием протеолитических ферментов.

При кислотном гидролизе белка разрушаются некоторые аминокислоты: триптофан подвергается полному разрушению, а серин, треонин, цистин, тирозин, фенилаланин – частичному. Однако процент разрушения этих аминокислот невелик. При щелочном гидролизе белка отмечается более сильное разрушение аминокислот. Гидролизаты белка применяются в качестве лечебных препаратов.

1 Кислотный гидролиз простого белка

При кислотном гидролизе белки распадаются сначала на высокомолекулярные пептиды, затем на низкомолекулярные пептиды, дипептиды и, наконец, на аминокислоты. Полный гидролиз белка протекает при многочасовом кипячении раствора в круглодонной колбе с воздушным холодильником в присутствии соляной или серной кислоты.

Реактивы:

1. Водный раствор яичного или растительного белка.

2. Соляная кислота (HCl), концентрированная.

3. Гидроксид натрия (NaOH), 10 %-ный раствор.

4. Серная кислота (H₂SO₄), 1 %-ный раствор.

Выполнение работы. Для гидролиза в круглодонную колбу отмеривают 20 мл раствора яичного белка и 5 мл концентрированной соляной кислоты, колбу закрывают пробкой с длинной стеклянной трубкой и закрепляют на штативе с асбестовой сеткой. Содержимое кипятят (под тягой) 45–90 мин. По окончании кипячения в пробирку наливают 5 капель гидролизата белка и нейтрализуют 10 %-ным раствором щелочи по красному лакмусу (опускают кусочек лакмуса в пробирку и помешивают стеклянной палочкой). После нейтрализации гидролизата (при посинении лакмуса) проводят биуретовую реакцию.

Промежуточные продукты распада белка – пептоны – при проведении биуретовой реакции дают розовое или красное окрашивание, а белки – сине-фиолетовое. При полном гидролизе белка (2,5 часа) до аминокислот биуретовая реакция с гидролизатом белка отрицательная.

2 Формоловое титрование (по Серенсену)

При гидролизе белка вследствие разрыва пептидных связей в нем происходит нарастание одновременно карбоксильных и аминных групп в эквивалентных количествах. Для определения количества карбоксильных групп используется метод Серенсена.

Аминокислоты в водных растворах образуют внутримолекулярные соли, поэтому без предварительного блокирования аминогрупп формальдегидом непосредственно титровать карбоксильные группы аминокислот щелочью невозможно. В процессе реакции с формальдегидом аминогруппа теряет свои основные свойства.

Образующееся метиленовое соединение (метиленаминокислота) легко может быть оттитровано щелочью. Определяя количество карбоксильных групп титрованием, одновременно можно судить и о содержании аминных групп, т.к. количество титруемых карбоксильных групп эквивалентно количеству связанных формальдегидом аминных групп. Метод формолового титрования позволяет следить за ходом гидролиза белка и изучать действие протеолитических ферментов.

Конец гидролиза белка совпадает с моментом, когда количество аминных и карбоксильных групп в гидролизате перестанет увеличиваться и наблюдается отрицательная биуретовая реакция.

Реактивы:

1. Водный раствор яичного или растительного белка.

2. Гидроксид натрия (NaOH), 0,005 н раствор.

3. Уксусная кислота (СН₃СООН), 1 %-ный раствор.

4. Формалин, 20 %-ный нейтральный раствор.

5. Соляная кислота (HCl), 1 %-ный раствор.

6. Фенолфталеин.

7. Уголь, тщательно измельченный.

Выполнение работы.

Титрование карбоксильных групп в растворе белка до гидролиза. Отмеривают в колбочку 1 мл раствора яичного белка, приливают 5 капель 20 %-ного нейтрального раствора формалина и 3 капли 0,5 %-ного раствора фенолфталеина. Титруют из микробюретки 0,005 н раствором NaOH до устойчивой бледно-розовой окраски.

Титрование карбоксильных групп после гидролиза белка (т.е. в гидролизате). Через 45 или 90 минут гидролиз прерывают, а в колбочку всыпают (на кончике ножа) уголь для обесцвечивания буроватого раствора, взбалтывают и кипятят 5 минут. Затем гидролизат охлаждают, выливают в цилиндр, доводят объем жидкости до 25 мл дистиллированной водой и фильтруют. Отмеривают в колбочку 1,25 мл гидролизата, добавляют 3 капли раствора фенолфталеина и нейтрализуют 10 %-ным раствором NaOH из бюретки до слабо-розовой окраски. Если при нейтрализации окраска делается ярко-красной, то добавляют до обесцвечивания по каплям 1 %-ный раствор уксусной кислоты, избыток которой нейтрализуют 1 %-ным раствором NaOH до слабо-розовой окраски. Затем приливают 5 капель нейтрального 20 %-ного раствора формалина и обесцвеченный раствор титруют 0,005 н. раствором NaOH до бледно-розового цвета и точно отмечают количество затраченной щелочи в таблице:

Объем NaOH, пошедшего на титрование, мл	Расчет азота
	до гидролиза белка	после 45 минут гидролиза белка	после 90 минут гидролиза белка

Расчет азота аминогрупп производят по количеству затраченной щелочи, исходя из ее нормальности.

Сформулируйте цель работы, сделайте вывод о продуктах разных типов гидролиза белка и о количестве азота в исследуемом объекте.

Лабораторная работа 5
Качественные реакции на инсулин

Инсулин, являющийся по своей природе белком, можно обнаружить с помощью цветных реакций с щелочным раствором сульфата меди и с реактивом Фоля.

Реактивы:

1. раствор инсулина (фармакопейный препарат).

2. Гидроксид натрия (NaOH), 10 %-ный раствор.

3. Сульфат меди (CuSО₄), 1 %-ный раствор.

4. Реактив Фоля (30 %-ный раствора NaOH и 5 %-ный раствора (CH₃COO)₂Pb).

Выполнение работы. В две пробирки наливают по 5 капель раствора инсулина.

В первую пробирку добавляют 5-10 капель 10 % раствора NaOH и 2–3 капли 1 % раствора CuSО₄.

Во вторую пробирку добавляют 5 капель реактива Фоля, доводят содержимое до кипения.

Результаты опытов занести в таблицу:

№	Название реакции	Окраска	Объяснение результата
1.
2.

Сформулируйте цель работы и сделайте вывод о причинах изменения окраски в ходе проведенной реакции.

Лабораторная работа 6
Качественное определение адреналина

Адреналин можно обнаружить с помощью цветной реакции с иодитом калия в кислой среде. При подогревании смеси развивается интенсивное красно-фиолетовое окрашивание. Адреналин обладает слабощелочной реакцией, легко окисляется на воздухе с образованием адренохрома, вследствие чего раствор с хлорным железом окрашивается в зеленый цвет. Реакция с хлорным железом характерна для пирокатехинового кольца, входящего в молекулу адреналина.

Реактивы:

1. раствор адреналина (эпинефрина).

2. Иодат калия (КIO₃), 1 %-ный раствор.

3. уксусная кислота (СН₃СООН), 10 %-ный раствор.

4. Хлорид железа (III) (FeCl₃), 3 %-ный раствор.

Оборудование: пробирки, пипетки, термостат на 60–65 ºС (или спиртовка).

Выполнение работы. В две пробирки наливают по 10 капель раствора адреналина.

В первую пробирку добавляют 5 капель 1 % раствора КIO₃ и 3 капли 10 % уксусной кислоты. Смесь нагревают (60–65 ºС). Отмечают окраску.

Во вторую пробирку добавляют 1 каплю (не более) 3 % раствора FeCl₃. Отмечают окраску.

Результаты занести в таблицу:

№	Используемые реактивы	Окраска	Объяснение результата
1.
2.

Сформулируйте цель работы и сделайте вывод о причинах изменения окраски в ходе проведенной реакции.

---